液相色谱柱-柱效测试DEMO指南：为什么我测的柱效就是没有COA报告高？

一、 DEMO说明

在色谱柱柱效测试时，有较多因素影响柱效测试结果，我们于此特列出各种影响及注意事项。

二、 柱效测试影响因素

1.系统扩散体积

定义：系统扩散体积影响色谱柱性能，包括进样器到流通池的体积。 仪器系统扩散体积是指对色谱柱性能有很大影响，尤其是小颗粒色谱柱。

扩散体积来源组成：

图1

仪器本身死体积具体影响：

2.1*50mm 1.6μm CORTES C18 乙腈/水=70:30（v/v）

0.4ml/min 0.5ul 丙酮，苯，二氢苊

结论：死体积增加会降低柱效、会发生额外扩散、柱效降低。小内径色谱柱（2.1mm）或体积较小的色谱柱受柱外体积影响，对柱效的影响更大。

案例1:

色谱柱：

Waters ACQUlTY UPLC BEH C18, 1.7 µm, 2.1 mm X 50 mm (PN 186002350）测试二氢苊

产品详情请点击：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱 186002350

附：测试系统扩散体积的方法：

用二通代替色谱柱，连接管路后，按照如下方法测试系统扩散体积。

系统扩散体积计算公式：

扩散体积位μL=4.4% 峰高处的三次平均峰宽（min）×流速（mL/min）×1000

计算示例：

2. 流动相对柱效测试结果的影响

流动相中有机相与水相的比例对峰高、 峰面积以及柱效均可能有影响。

案例2:

色谱柱：Waters BEH C18 1.7um 2.1×50mm (PN 186002350 ）测试结果（流速：0.35ml/min)

产品详情请点击：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 色谱柱 186002350

3. 不同柱效测试液

不同厂家，不同类型的色谱柱其柱效测试的化合物各不相同，如反相色谱柱可选苯、荼、苊等各种类型的检测方法，尽量采用与厂家相同的化合物测试。

Waters XBridge BEH C18 1.7μm 2.1x50mm 测试不同化合物的结果：

产品详情请点击：Waters XBridge BEH C18色谱柱 186003117

Xterra C18 5.0μm 4.6×250mm测试不同化合物的结果：

产品详情请点击：Waters XTerra MS C18 色谱柱 186000494

4．不同柱内径的影响：

死体积对不同柱内径大小有不同影响 宽内径影响较小，窄内径影响较大。

案例3:

三、正确的柱效测试演示实验

1.    COA报告

                              图8

2. 仪器

高效液相色谱仪，需配备合适的检测器（如紫外－可见检测器、荧光检测器等）、进样器和色谱柱恒温箱。

注：关注仪器的死体积情况，尽量选择死体积小的连接管路和检测器流通池，尤其是在使用小规格色谱柱时。

四、 操作步骤

若仪器系统之前使用过高盐体系，建议先用纯水冲洗5-10min后， 再接如下步骤操作：

a)    仪器接两通，待用管路放置新鲜有机相（乙腈或甲醇），灌注5min后先用有机相（乙腈或甲醇）冲洗系统约5min 。

b)    将色谱柱连接至系统上，以0.1ml/min开始缓慢增加流速至0.8 mL/min，小粒径色谱柱可降低流速。用有机相（乙腈或甲醇）冲洗色谱柱，约20 min。

c)    更换柱效测试流动相， 缓慢调节流速至测定流速，平衡色谱柱，一般需5-10倍柱体积，直至压力和基线稳定。 在平衡过程中，密切关注压力变化，若压力异常波动，可能存在堵塞或泄漏等问题，需及时排查。

d)    准确吸取适量测试标准品，为保证结果准确，通常重复进样3次，记录下每次测试数据。

e)    根据测得理论塔板数结果计算柱效，EP和USP理论塔板数有区别。

五、 注意事项

若测试结果柱效明显偏低、 峰形拖尾、 柱压较高，需全面排查问题。

a） 检查色谱柱是否污染， 可通过冲洗色谱柱或更换保护柱进行验证。

b） 确认流动相比例是否准确。

c）  检查仪器系统，包括连接管路是否有泄漏、 堵塞， 检测器是否正常工作等， 同时考虑死体积是否过大对柱效产生了不良影响。

若对相关内容还有任何疑问或者难题，请联系Waters授权代理商——广州绿百草。