尺寸排阻色谱柱是一种广泛应用于生物分析领域的工具,其工作原理主要基于分子大小差异进行分离。利用柱内固定相中孔隙与分子间的物理作用来实现分离。具体来说,聚合物分子在柱子中的孔道中被筛选,较大的分子无法通过尺寸较小的孔道,只有较小的分子才能通过这些孔道,从而实现不同分子尺寸的分离。其优点在于其分离速度快、操作简单、分离效果好。此外,该技术不依赖于分子之间的亲和性或化学性质,因此适用于各种生物大分子,如蛋白质、多肽和核酸等的分离。
1、样品制备:
清洁与溶解:确保样品的清洁度,避免杂质干扰分析结果。将样品溶解在适当的溶剂中,使其形成均匀的溶液。
过滤:为了去除可能存在的微小颗粒或杂质,需要对样品溶液进行过滤,以防止堵塞色谱柱。
定量:准确测量样品的体积和浓度,以便在后续分析中进行准确的计算和比较。
2、柱装载:
填充剂选择:根据待分离物质的分子大小和性质,选择合适的填充剂。填充剂通常由具有不同孔径大小的多孔球形颗粒组成,如硅胶、聚合物等。
装载方式:将填充剂均匀地装入色谱柱中,确保填充剂的紧密性和均匀性,避免出现空隙或不均匀的情况。
溶液平衡:在装载填充剂后,使用适当的缓冲液对色谱柱进行平衡,以使填充剂充分润湿并达到稳定的工作状态。
3、运行参数设置:
流速控制:根据样品的性质和色谱柱的要求,设置合适的流速。流速过快可能导致分离效果不佳,流速过慢则会增加分析时间。
缓冲液浓度和pH值调节:流动相缓冲液的浓度和pH值对分离效果有重要影响。一般来说,缓冲液的pH应为7左右,并适度调整盐浓度。对于疏水蛋白,可加入一定量的有机溶剂;对于易于离子化的蛋白,则需要提高缓冲盐浓度。
4、检测方法选择:
紫外检测:是常用的检测方法之一,通过检测样品在特定波长下的吸光度来确定其浓度。蛋白检测最常见的紫外波长是280nm,吸收值主要取决于酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)的含量。
蒸发光散射检测:适用于没有紫外吸收或紫外吸收较弱的物质,通过检测样品溶液在加热后产生的蒸汽散射光强度来测定其浓度。
粘度检测:可以提供关于大分子结构、构象、聚集以及支化等方面的信息,但通常需要与其他检测技术结合使用。
5、数据处理:
峰面积计算:根据检测器输出的信号峰面积,计算样品中各个组分的含量。
分子量测定:通过制作标准曲线,将未知样品的洗脱时间与已知分子量的标准品进行比较,从而测定未知样品的分子量。
6、清洗与保存:
清洗:多次使用后某些样品可能会吸附到入口筛板或填料上,当积累到一定程度时会出现压力升高并伴随峰型展宽的现象,此时需要清洗色谱柱。一般流程为断开检测器,反接色谱柱,在低于50%较大推荐流速下用清洗液冲洗10-15倍柱体积。
保存:日常使用中,建议将色谱柱保存在150mM磷酸盐缓冲液中(pH7.0)。如长期不用时,可将色谱柱保存至20%乙醇中,以防止菌体污染。