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为什么你的色谱柱柱效总是测不好

更新时间:2022-10-26点击次数:734

色谱从1903年开创至今,已经120年,是重要的一门科学,在制药,食品、环境、能源等领域都有非常广泛的应用,可以肯定的是未来分析测试进步依然离不开色谱。


由于中国在色谱发展起步时间晚,作为从业人员的你是不是也经常碰到这样的困惑:



开发方法中,如何进行色谱柱的选择?

色谱柱如何冲洗维护,增加使用寿命?

SPE小柱前处理的开发流程?

为什么这次购买的色谱柱坏的这么快?

样品瓶是否可以重复使用?

………


可以理解大家碰到的实际应用问题是很多的,但却苦于书本上的经验太少,也没有太多可以咨询的通道,遇到问题仅仅只能请教身边的同事或同学,真正问题得不到系统性的解决,这严重阻碍了中国色谱的发展。


色谱圈汇聚各行业经验达人、各大厂商工程师、自建的技术支持团队为广大分析人员提供免费、高效、有趣的技术咨询平台。


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这一期,我们来讨论柱效,即理论塔板数。


那什么是理论塔板数?

理论塔板数是基于经典的塔板理论,理论很不好理解,

我们可以用图片上蓝色和红色区域的小横线来表示,实际上这些横线是不存在色谱柱里面的,横线数量越多,表示柱效越高。

一般认为不同物质在柱里分离效果越好,代表柱子越好,在同类型柱子,分离效果(Rs)只与柱子的理论塔板数(n)有关,n越大,分离效果越好。

所以,为了增加Rs,我们需要追求高柱效。


根据n=L(柱长)/H(理论塔板数高度)可以得出,柱长越长,分离效果越好,例如: J&W DB-5ht 30m(柱长)*0.25mm(内径),0.1μm(颗粒半径)的柱子就会比 J&W DB-5ht 15m*0.25mm,0.1μm的要高,但柱长会增加会导致压力增大,分析时间增加,峰宽增大,所以一味追求柱长不可取,因此降低理论塔板高度也是可行方式。

根据范第姆特方程,H=A+B/u+C*u

流速对理论塔板高度的影响

u为流动相流速,可见流速对理论塔板高度是两方面的,B项是反函数,而C项是一次函数,因此,在较高流速范围内降低流速对C项影响较大,对B项影响较小。此外,流速还会影响压力,分析时间,峰宽等,所以选取适当降低流动相流速可提高柱效。

填料粒径会影响范第姆特方程中AC项,简单来说,填料粒径越小,A,C两项越小,柱效越高,例如:Xbridge C18 4.6*250mm 3um的柱子就会比Xbridge C18 4.6*150mm 5um的要高,但填料粒径受制作工艺技术所制约。

柱温对柱效的影响

柱温对B,C两项都有影响,温度越高,简单来说B项越高而C项越低,但对C项影响更大,因此提高柱温能提高柱效,但柱子跟仪器有一定受热范围,过高的温度可能会导致填料变性,测试物质变性等。


除此之外,填料颗粒结构,流动相粘度,填料厚度都会有影响。


总的来说:

提高柱效方法有:

1,减少填料粒径

2,选用低粘度溶剂做流动相

3,适当范围内降低流速

4,减少填料空穴深度

5,适当范围内提高柱温

6,增加柱长等


那我们如何测试柱子的柱效呢?

柱子包装内会有柱子的COA(Certificate of analysis),如图所示,COA内会给定实验条件与测试物质,以及测试后得到的塔板数,分离度,不对称因子等,在用COA上实验条件测试得到数据后与或以前的数据做比较。

定期做柱效测试,便于追踪色谱柱的性能变化。


然而,有经验的分析人员会发现实验室测的柱效会比COA报告的低!!

仪器型号:岛津LC-2010-CHT


image.png

仪器型号:Waters 2695

那么为什么实验室测的柱效会比COA报告的低?

其实主要原因来源如下:

1, 实验室测试条件与COA报告要求不一致;

2, 仪器不同,管线内径越大,扩散体积越大,柱外效应大;

3, 仪器检测器采样频率设置过低,影响峰型;

4, 最容易忽略的是,进样量(进样浓度*进样体积)过大,导致峰超载;

5, 色谱柱在不正确的机器上使用,例如:UPLC柱在普通HPLC上测柱效。


其实柱效的因素还有很多,欢迎大家提出。

请注意:色谱柱厂家测试COA数据所使用的色谱系统是专门设计的,其系统扩散体积非常低,测试出柱效为理想情况下,而实验室仪器的管路连接,操作环境,系统电路,所使用溶剂质量都会不同,因此多数厂商默认﹐只要对应峰的柱效结果达到COA报告的70%或以

上均认为色谱柱没有质量问题。

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