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分离 LC 峰是否让您头疼?

更新时间:2022-11-11点击次数:811

您的方法中的分裂峰是否让您彻夜难眠?您将在下面找到一些可能导致这些分裂峰的原因,以及如何解决问题。


有几个问题需要回答,以确定从哪里开始调查峰分裂的根本原因。方法中的所有峰都分裂还是只有一个或几个峰分裂?您是否总是在您的方法中观察到分裂峰,或者它们似乎突然开始发生?首先弄清楚这些答案可以让您知道从哪里开始进行故障排除。


如果只有*早的洗脱峰分裂,这可归因于稀释剂不匹配。这可以通过使用较弱的溶剂稀释样品或使样品稀释剂与起始流动相条件相匹配来解决。这也可以通过注入更少量或使用更大的色谱柱来解决。请参见下面图 1 和图 2 中的不匹配稀释剂示例。


图 1:使用甲醇作为稀释剂分析 2 种酰基肉碱的方法条件和色谱图。



图 2:使用流动相 A 作为稀释剂分析 2 种酰基肉碱的方法条件和色谱图。


如果方法中只有一个或几个峰发生分裂,则要排除的下一个问题是它实际上是一个峰分裂成两个,还是它们是共流出峰。可能存在与您的分析物共流出的基质干扰。在这种情况下,请尝试注入空白基质样品以排除任何共流出问题。另一个原因可能是样品的浓度或进样量过高,这可能会导致样品过载,从而导致分离峰。尝试注入较小的样品体积,如果您注意到仍然有两个不同的峰,那么可能是时候回顾一下您的方法并努力调整条件以提高选择性。  


另一个可能导致您的方法出现分裂峰的变量是流动相的 pH 值是否太接近分析物的 pKa。一般的经验法则是根据分析物的 pKa 调整流动相 2 个或更多单位的 pH 值。分裂峰可能是由分析物在特定 pH 下的电离状态引起的。如果 pH 值与分析物的 pKa 太接近,则会出现多种电离状态,从而导致分析物出现多个峰。在这些情况下,尝试将您的流动相 pH 值调整 +/- 2 并运行几个样品,看看这是否有助于峰分裂。


不溶性是另一个可能导致方法中峰分裂的因素。为避免这种情况,重要的是要确保样品在稀释剂和流动相中都可溶。如果它不溶于其中之一,它可能会导致分裂或扭曲的峰。

如果分裂峰在您的方法中通常不是问题,而您突然注意到分裂峰,这可能表明存在几个问题。污染是导致分裂峰的另一个因素。就流动相而言,使用新鲜溶液也很重要,如果使用 MS 检测,则应使用 LC-MS 级溶剂。仅使用制造商在色谱柱上推荐的流动相,并在适当的条件下清洗和储存也很重要。


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